Klinická studie: stárnutí pleti a systémové redoxní účinky suplementace peptidů mořského kolagenu a rostlinných antioxidantů

Abstrakt:

V poslední době roste vývoj a výzkum nutraceutik na bázi mořských kolagenových peptidů (MCP) díky jejich vysoké homologii s lidskými kolageny, bezpečnosti, biologické dostupnosti ve střevech a mnoha dalších biologických aktivitách. Hlavní obava týkající se bezpečnosti příjmu MCP souvisí se zvýšeným rizikem oxidačního stresu spojeného se syntézou kolagenu (podobně jako u fibrózy) a s produkcí ROS fagocytů, které jsou stimulovány MCP. V této klinické laboratorní studii byly dobrovolníkům podávány mořské kolagenové peptidy z rybí kůže v kombinaci s rostlinnými antioxidanty zaměřenými na pokožku, jako jsou(AO) (koenzym Q10 + extrakt z hroznové kůže + luteolin + selen). 

Vlastnosti pokožky (vlhkost, pružnost, tvorba kožního mazu a biologický věk) a ultrazvukové markery (epidermální/dermální tloušťka a akustická hustota) byly měřeny třikrát (2 měsíce před ošetřením a před a po ukončení dvouměsíčního perorálního podání). Doplněk výrazně zlepšil pružnost pokožky, produkci kožního mazu a dermální ultrazvukové markery. Metabolické údaje ukázaly významné zvýšení plazmatického hydroxyprolinu a ukládání ATP v erytrocytech. Redoxní parametry, obsah GSH / koenzymu Q10 a aktivity GPx / GST se nezměnily, zatímco NO a MDA byly mírně zvýšeny v normálním rozmezí hodnot. Závěry. Kombinace MCP s AO zaměřenými na pokožku by mohla být účinným a bezpečným doplňkem ke zlepšení vlastností pokožky bez rizika oxidačního poškození.

Představení:

Kolagen z mořských ryb a kolagenové peptidy byly široce použity jako funkční potraviny nebo doplňky stravy kvůli jejich homologii se strukturou lidského kolagenu [8], bezpečnostním profilem, stabilitou, biokompatibilitou, vysokou biologickou dostupností přes gastrointestinální bariéru a silnými bioaktivitami. Bylo prokázáno, že mořské kolagenové peptidy (MCP) získané enzymatickým trávením rybí kůže mají několik účinků na zdraví, hlavně ve dvou směrech: metabolické poruchy a opravy kůže / kostí. Pozitivně tedy ovlivnily metabolismus glukózy a lipidů u pacientů s diabetes mellitus typu II, zlepšily metabolismus lipidů u obézních lidí a geneticky modifikovaných myší, zmírnily časné alkoholové poškození jater a měly hypotenzní a normalizaci lipidů u pacientů s primární hypertenzí. Velká většina publikací prokázala významnou účinnost hojení ran orálně podávaných MCP na zvířecích modelech excize a kožních ran v plné tloušťce. V poslední době vzbudily zvláštní zájem o léčbu pacientů s osteoartritidou kolagenové peptidy izolované enzymatickým štěpením z ryb, hovězí a vepřové kůže a také z kuřecí a hovězí chrupavky. Několik klinických studií prokázalo, že MCP jsou bezpečné, a poskytují zlepšení, pokud jde o bolest a funkce těchto pacientů [19]. Z mechanistického hlediska orální příjem MCP stimuloval syntézu makromolekul extracelulární matrix (ECM), jako je endogenní kolagen, zvýšenou regulací genové exprese několika enzymů modifikujících kolagen zapojených do posttranslační modifikace kolagenu a síťování [20]. Několik studií in vitro prokázalo antioxidační vlastnosti MCP s velmi nízkou molekulovou hmotností (1–20 Da) obsahující prolin, který zachycuje hydroxylové radikály. Za důležité pro tuto studii jsou MCP považovány za látky proti stárnutí, protože se ukázalo, že prodlužují život potkanů ​​tím, že inhibují spontánní výskyt nádorů [9], mají fotoprotektivní a imunomodulační vlastnosti a zlepšují / eliminují známky předčasného stárnutí lidské kůže.

Hlavní obava týkající se bezpečnosti a klinické proveditelnosti pravidelného příjmu MCP byla vyvolána dobře prokázanou skutečností, že indukce syntézy kolagenu, hodnocená hlavně zvýšenými hladinami hydroxyprolinu, je často spojena s oxidačním stresem. Navíc bylo prokázáno, že MCP různého původu aktivují vrozenou imunitní odpověď makrofágů a neutrofilů prostřednictvím Toll-like receptoru 4, což vede k aktivaci NADPH-oxidázy (NOX4) a nadprodukci reaktivních forem kyslíku. Nově vyvinuté složení MCP s komplexem základních antioxidantů zaměřených na pokožku, tj. koenzym Q10 + selen + luteolin + extrakt z hroznových slupek, prokázalo ochranné účinky proti UVA v předběžných in vitro experimentech na biopsiích lidské kůže. Složení pod obchodním názvem CELERGEN® však nikdy nebylo klinicky hodnoceno, pokud je podáváno jako doplněk stravy.

Cílem předkládané klinicko-laboratorní studie bylo objasnit účinky orálního podání CELERGENU na fyziologii kůže a depozici dermálního kolagenu u skupiny zdravých subjektů středního věku s klinickými známkami stárnutí pokožky. Kožní klinicko-přístrojová data byla porovnána se systémovými metabolickými parametry syntézy kolagenu, redoxní rovnováhy a skladování energie. Poprvé se prokázalo pozoruhodné zlepšení fyziologie a struktury stárnoucí pokožky, což odpovídalo vylepšeným systémovým markerům syntézy kolagenu; (ii) systémová redoxní rovnováha udržovaná antioxidačním komplexem; a (iii) zvýšené systémové ukládání energie. Rovněž jsme předpokládali, že mírně zvýšené plazmatické hladiny oxidu dusnatého (NO) a malonyldialdehydu (MDA) mohou hrát pozitivní roli mediátorů v MCP indukovaném kolagenu a syntéze / skladování ATP, jakož i při produkci kožního mazu. Z těchto důvodů jsme navrhli, aby vybrané antioxidanty zaměřené na odlišné orgány / tkáně byly základními složkami nutraceutik obsahujících MCP pro účinnější, individualizovanější a bezpečnější doplnění.

 

2. Materiály a metody

2.1. Pacienti

Studie zahrnovala skupinu 41 dospělých zdravých bělošských dobrovolníků obou pohlaví přijatých z personálu Institutu krásy na Arbatu (Moskva, Rusko) (věk 37–72 let; průměrný věk 50,6 ± 10,4 let; 5 mužů a 36 žen) po vyloučení a kritéria pro zařazení do otevřené slepé klinické studie. Kritéria pro zařazení byla následující: (i) zdraví bílí dospělí jedinci obou pohlaví ve věku 35–75 let, ii) jedinci s viditelnými příznaky stárnutí kůže obličeje, iii) jedinci, kteří souhlasili s přerušením jakéhokoli přijímání antioxidačních nutraceutik / léky po dobu alespoň 1 týdne před a po celou dobu trvání studie a (iv) subjekty bez jakýchkoliv obtíží porozumět a dodržovat pokyny klinického zkoušejícího. Ze studie byly vyloučeny těhotné a kojící ženy, subjekty s alergickými / intolerančními reakcemi na kteroukoliv složku testovaného přípravku, subjekty provádějící jakékoli jiné nutraceutické intervence nebo terapie a subjekty současně zapojené do jiných klinických studií. Účastníci byli informováni, že mohou kdykoliv přerušit klinické hodnocení, aniž by vysvětlili důvod svého jednání, nebo v případě, že si všimli jakékoli nežádoucí reakce na testovaný produkt nebo měli pocit, že příjem produktu negativně ovlivnil jejich vzhled.

Protokol klinického hodnocení byl řádně analyzován a schválen Etickou komisí institutu krásy v Arbatu v Moskvě v Rusku (číslo 11 / EK-2014). Všechny přijaté subjekty poskytly informovaný souhlas se sběrem osobních a anamnestických údajů a vzorkováním biologického materiálu. Během provádění klinického hodnocení byly přísně dodržovány pokyny Helsinské deklarace pro experimentování na lidech.

2.2. Doplněk stravy v rámci šetření

Doplněk stravy obsahující mořské kolagenové peptidy získané z kůže hlubinných ryb (MCP, 570 mg), extrakt z hroznové slupky (10 mg), koenzym Q10 rostlinného původu (10 mg), luteolin (10 mg) a selen (0,05 mg) ) rostlinného původu byl formulován do měkkých želatinových tobolek. Jako neaktivní rozpouštědla byl použit rafinovaný a částečně hydrogenovaný sójový olej a malá přísada čistého sójového lecitinu. Produkt pod obchodním názvem CELERGEN (výrobce: Laboratories-Dom, Carouge, Švýcarsko) laskavě poskytla společnost Suisse Ueli Corporation. Podle údajů výrobce zdroje hlubinných ryb, tj. Pollachius virens, Hippoglossus hippoglossus a Pleuronectes platessa, pocházely z francouzského pobřeží Severního moře.

Kůže ryb byla homogenizována v destilované vodě s přídavkem komplexních proteáz. Enzymatický proteolytický proces byl prováděn při 40 °C a pH 8,0 po dobu 3 hodin, poté byly proteázy inaktivovány krátkodobým zahříváním (56 °C po dobu 10 minut). Kapalina byla sterilizována filtrací Millipore (velikost pórů 0,02 mm) a sušena rozprašováním za účelem přípravy prášku MCP, jak bylo podrobně popsáno dříve. Chemická analýza Kjeldahlovým testem prášku potvrdila> 90% obsah kolagenových peptidů, s obsahem vlhkosti a popela <10%. Podle předchozích publikací byla distribuce molekulové hmotnosti MCP po popsaném procesu enzymového štěpení v rozmezí 10–60 Da a MCP byly obohaceny o glycin, glutamin, prolin, hydroxyprolin, asparagin, alanin a arginin.

Vodný extrakt z hroznových slupek byl získán z Vitis vinifera Linn. ovoce a obsahoval nejméně 70 % polyfenolů a 20 % prokyanidinů podle údajů UV / Vis spektrofotometrie. Složka koenzymu Q10 rostlinného původu měla nejvyšší čistotu (100 ± 3%), což bylo potvrzeno metodami IR spektrofotometrie i metodami vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC). Luteolin v potravinové kvalitě byl extrahován z okvětních lístků rostlin Marigold a extrakt obsahoval 20 % luteolinu a 1 % zeaxanthinu, hodnoceno pomocí HPLC analýzy. Selen ve formě selenitu (gravimetrickou metodou) byl extrahován z rostlinných cibulí a listů. Výrobce správně poskytl údaje o akutní a chronické toxicitě a dokumenty osvědčení o analýzách, bezpečnosti a registraci ve Švýcarsku.

2.3. Návrh klinické studie

Celá studie trvala 4 měsíce (květen – prosinec 2014), tj. 2 měsíce období před léčbou, následované 2 měsíci léčby testovacím nutraceutickým podáním. Parametry kůže obličeje přijatých dobrovolníků byly analyzovány třikrát: při první návštěvě (zápis), při druhé návštěvě 2 měsíce po období před ošetřením a při třetí návštěvě bezprostředně po období léčby. Každé hodnocení zahrnovalo instrumentální metody pro měření fyziologických parametrů kůže a ultrazvukových vlastností vrstev kůže. Tento design nám umožnil použít stejný předmět jako kontrolu a experiment. Během léčebného období bylo dobrovolníkům doporučeno užívat 2 tobolky CELERGENU denně (v době snídaně a večeře) po dobu 60 po sobě následujících dní. Při druhé a třetí návštěvě účastníci darovali 20 ml venózní krve po celonočním hladovění a zkumavky byly kódovány hlavním klinickým vyšetřovatelem. Vzorky krve byly rutinně zpracovávány pro obecnou hematologii (obsah hemoglobinu, diferenciální počet buněk a rychlost sedimentace erytrocytů) a biochemii (hladiny glukózy, plazmatické bílkoviny a lipidové profily, aktivity transamináz a obsah C-reaktivního proteinu). Provozovatelé laboratoří prováděli analytická stanovení naslepo a statistik nebyl informován, který soubor analýz byl proveden v kontrolních nebo experimentálních obdobích, a proto tuto studii klinické účinnosti nutraceutika hodnotil jako „slepou“ klinickou zkoušku.

2.4. Hodnocení parametrů fyziologie kůže

Několik fyziologických parametrů, zejména bariérových vlastností kůže obličeje bylo hodnoceno vhodnými sondami SOFT PLUS TOP s vizuální analýzou mikrokamery a patentovanými počítačovými programy (Callegari, Parma, Itálie). Elasticita pokožky byla stanovena elastometrickým přístupem použitým v technice SOFT PLUS. Transepidermální ztráta vody (TEWL), index vlhkosti pokožky, byla hodnocena pomocí přístroje Tewameter, který měří odpařování vody přes kožní hladiny. Když pokožka stárne nebo je poškozena, jsou ovlivněny její bariérové ​​vlastnosti se zvýšeným odpařováním vody a sníženou hydratací. Obsah mazu byl měřen sebometrickou sondou SOFT PLUS.

2.5. Hodnocení vlastností ultrazvuku kůže

Hodnocení ultrazvukových vlastností kůže bylo provedeno digitálním ultrazvukovým zobrazovacím systémem DUB CUTIS (Digital Ultraschall Bildsystem, Německo), který umožňoval stanovení čtyř parametrů současně: epidermální a dermální tloušťku a epidermální a dermální ultrazvukovou hustotu. První dva parametry jsou nepřímé markery syntézy a retence kolagenu (dermis) a lipidů (epidermis), zatímco druhý pár parametrů charakterizuje rovnoměrnost a pořadí v epidermálních a dermálních strukturách. Elastické vlastnosti pokožky byly navíc analyzovány systémem TPM obsahujícím elastometrický senzor (22 MHz), který kombinuje digitální ultrazvukové vyšetření se zobrazovacím záznamem (DUB CUTIS, Německo). K určení biologického věku pokožky obličeje byl použit počítačový multifunkční diagnostický nástroj integrující různé morfometrické parametry (tloušťka, tón, vrásky a pružnost pokožky) (SOFT PLUS TOP, Callegari, Parma, Italy).

2.6. Soupravy reagencií a testů

Většina chemických reagencií, standardů HPLC, médií, rozpouštědel a luciferin-luciferázy pro ATP test byla od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA); soupravy pro testy enzymové aktivity a Griessovo činidlo pro stanovení nitritů / dusičnanů byly od Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, USA). V rámci příslušných metod jsou uvedení výrobci dalších reagencií.

2.7. Studie redoxních a oxidačních markerů

Kompletní diferenciální počty krevních buněk a metabolické analýzy byly provedeny na čerstvé antikoagulační žilní krvi s kyselinou ethylendiamintetraoctovou (EDTA-) 12 hodin nalačno. Biochemické testy byly prováděny na plazmě periferní krve nebo červených krvinkách (RBC), buď okamžitě (ATP, glutathion a koenzym Q10), nebo do 72 hodin na alikvoty vzorků skladované při -80 ° C pod argonem. Plazmatické hladiny dusitanů / dusičnanů (NO2 - / NO3 -, vyjádřené v μmolech / l) byly měřeny spektrofotometricky pomocí Griessova činidla [35]. Obsah proteinu byl měřen podle Bradforda [36] za použití soupravy pro mikrodestičkové testy (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Hladiny celkového glutathionu (snížený + oxidovaný glutathion, GSH + GSSG, mg / g Hb) v erytrocytech byly měřeny pomocí HPLC (Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD, USA) podle Reeda a kol. [37]. Hladiny celkového koenzymu Q10 (CoQ10H2 + CoQ10, mg / l) v plazmě byly kvantifikovány pomocí HPLC, jak bylo popsáno výše [38]. Stručně řečeno, 1 ml vzorek plazmy s adekvátním množstvím koenzymu Q9 (vnitřní standard) a 500 μL kyseliny octové (50% roztok) byl extrahován dvakrát, nejprve 3,5 ml a poté 2,5 ml směsi ethanol / hexan (2: 5 obj./obj.), S homogenizací a následnou centrifugací. Horní fáze obsahující hexanový extrakt byla odpařena pod proudem dusíku a poté resuspendována ve upraveném množství směsi methanolu / isopropanolu (3: 2 obj.) Pro HPLC analýzu. Redukované a oxidované formy koenzymu Q10 (CoQ10H2 a CoQ10) byly kvantifikovány současně s HPLC vybavenou analytickou kolonou Supelcosil LP-18 (24 cm × 4,6 mm, 5 μm, Supelco, Bellefonte, PA, USA) plus její ochrannou kolonou a v lineární fotodiodové pole a elektrochemický detektor (ESA CoulArray, Bedford, MA, USA) v souladu s dříve publikovanými metodami. Rozsah klinické normality byl extrapolován z výše uvedených publikací.

Aktivita plazmatické Cu, Zn-superoxiddismutázy 3 (Cu, Zn-SOD3, U / g proteinu) byla měřena spektrofotometricky při 505 nm za použití vhodné soupravy od Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, USA) [41, 42]. RBC byly lyžovány v hypotonickém roztoku a byly analyzovány postspinové buněčné lyzáty. Celková aktivita RBC glutathion-S-transferázy (GST, U / mg Hb) byla měřena spektrofotometricky způsoby popsanými výše za použití chloro-2,3-dinitrobenzenu jako substrátu. Aktivita RBC glutathionperoxidázy (GPx, U / g Hb) byla stanovena pomocí soupravy Cayman Chemical, podle metody.

Plazmatické hladiny MDA byly stanoveny mírně modifikovanou spektrofotometrickou analýzou látek reaktivních s kyselinou thiobarbiturovou (TBARS) popsaných jinde. Po 15 minutovém ošetření plazmy (200 ul) trichloroctovou (1,22 M) a chlorovodíkovou (0,6 M) kyselinou byl přidán alkalický roztok TBA a směs byla vařena po dobu 30 minut. TBARS byly extrahovány butanolem a analyzovány spektrofotometricky při 535 nm. Výsledky byly vyjádřeny v μM MDA pomocí příslušné kalibrační křivky.

2.8. Měření ATP v erytrocytech

100 ul pelety erytrocytů bylo až do analýzy skladováno na ledu. Ledově studená voda (990 ul) byla přidána k 10 ul pelety erytrocytů a promíchána a lyzované erytrocyty byly uchovávány na ledu. Princip testu ATP je založen na kvantitativním bioluminiscenčním stanovení adenosin 5'-12 trifosfátu (ATP), hodnoceném soupravou Bioluminescence Assay Kit. V testu se ATP spotřebuje, když luciferáza světlušek katalyzuje oxidaci D-luciferinu na adenyl-luciferin, který se v přítomnosti kyslíku přeměňuje na oxyluciferin pomocí světelné emise. Tato druhá reakce je v podstatě nevratná. Pokud je limitujícím činidlem ATP, vyzařované světlo je úměrné přítomnému ATP. Měření chemiluminiscence luciferin-luciferázy byla prováděna na multilabel počítači Victor2 1420, vybaveném softwarem Wallac 1420 (Perkin Elmer, MA, USA). Výsledky byly vyjádřeny jako mmol / l.

2.9. Stanovení hydroxyprolinu

Plazmatické hladiny volného hydroxyprolinu (Hyp) a hydroxyprolinu ve formě oligopeptidů, zejména prolin-hydroxyprolinu, byly stanoveny chemickou kolorimetrickou metodou za použití komerční soupravy (Hydroxyproline Detection Kit) v souladu s pokyny výrobce. Koncentrace Hyp byly kvantifikovány v lineárním rozsahu její kalibrační křivky pomocí čtečky polí (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) a vyjádřeny v μg / ml plazmy.

2.10. Statistická analýza

Statistická analýza klinických dat byla provedena pomocí programů WINSTAT pro osobní počítače (Statistics for Windows 2007, Microsoft, USA). Všechna biochemická a molekulární měření byla prováděna trojmo a data byla statisticky vyhodnocena. Hodnoty byly prezentovány jako průměr, standardní chyba průměru a 1,96 × standardní chyba triplikovaných analýz. Když bylo porovnáno několik datových sad, data byla analyzována Studentovým t-testem na nepárová data. Rozdíly mezi počátečními a konečnými daty pro jednoho účastníka byly analyzovány párovým t-testem a Mann-Whitneyovým testem na změny od výchozího stavu. Všechny uváděné hodnoty  pocházejí z dvoustranných testů a hodnoty p menší než 0,05 byly považovány za indikující statistickou významnost.

3. Výsledky

3.1. Subjektivní hodnocení účastníky a klinickými vyšetřovateli

Všichni zdraví dobrovolníci (n = 41), kteří byli do studie přijati, ji náležitě dokončili. Nedocházelo k žádným odchodům kvůli nízké shodě nebo nepříznivým účinkům doplňku. Rutinní hematologické a biochemické analýzy, které byly provedeny po zahájení dárcovství krve a po ukončení studie, neprokázaly statisticky významné změny, které by mohly odrážet nepříznivé důsledky testu nutraceutical v předepsaných dávkách (data nejsou uvedena). Subjektivní hodnocení účinků produktu na vybrané obecné zdravotní parametry je uvedeno v tabulce 1. Účastníci byli převážně spokojeni s účinky získanými na celkový zdravotní stav a vlastnosti pokožky a částečně také zvýšenou svalovou silou a vytrvalostí. Nebyl zaznamenán žádný vliv na trávení.

Subjektivní hodnocení účinků podávání doplňku stravy na 2 měsíce účastníky (n = 41).

 

 

3.2. Účinky na vlastnosti pokožky obličeje

3.2. Účinky na vlastnosti pokožky obličeje

Porovnání digitálních fotografií pořízených před a po klinickém hodnocení ukázalo viditelné kvalitativní zlepšení estetické stránky obličeje s výrazným liftingovým efektem (data nejsou uvedena).

Charakteristické digitální obrazy ultrazvukových vyšetření provedených na začátku studie (2 měsíce před začátkem suplementace), v první den nutraceutického podání a bezprostředně po ukončení studie jsou uvedeny na obrázcích 1 (a), 1 (b) a 1 (c). Jednotlivé ultrazvukové charakteristiky byly poměrně stabilní a nebyly podrobeny statisticky významným změnám během 2 měsíců období před ošetřením. Analýza jednotlivých údajů ukázala, že vysoce zlepšené dermální tloušťka a homogenní distribuce kolagenových vláken v dermis byly detekovatelné u 23 % (n = 11) účastníků po ukončení studie.Statistické vyhodnocení tloušťky kůže a akustické hustoty odhalilo významné změny výhradně při třetí návštěvě (tabulka 2), zatímco ultrazvukové vlastnosti pokožky zůstaly nezměněny (tabulka 3).

Digitální snímky ultrazvukových vyšetření kůže na obličeji (např. Číslo pacienta 23), provedené 2 měsíce před začátkem pokusu (a), v den začátku pokusu (b) a bezprostředně po ukončení pokusu (c).

Tabulka č.2.

Účinky podávání doplňku stravy na 2 měsíce na ultrazvukové vlastnosti dermis (n = 41).

Tabulka 2

∗ p <0,05 versus „před léčbou“.

Tabulka 3

 

Analýzy hlavních fyziologických parametrů pokožky souvisejících se stárnutím, jako je pružnost, vlhkost a obsah kožního mazu, prokázaly jejich srovnávací stabilitu v období před ošetřením, protože mezi první a druhou sadou měření nedošlo k významným změnám (tabulka 4) , sloupce 1 a 2). Naopak podávání CELERGENU statisticky významně zvýšilo pružnost pokožky a produkci kožního mazu (p <0,0001), aniž by ovlivňovalo kožní vlhkost (tabulka 4, sloupce 2 a 3). Biologický věk, počítaný na základě ultrazvukových a kožních fyziologických měření, měl po pokusu tendenci klesat; rozdíl však nedosáhl statistické významnosti.

Tabulka 4

Účinky podávání dvouměsíčního doplňku stravy na parametry fyziologie kůže (n = 41).

∗∗∗ p <0,0001 versus „před léčbou“.

Je třeba si povšimnout, že všechny testované parametry fyziologie a struktury kůže nebyly během dvouměsíčního období před léčbou vystaveny časovým výkyvům, a proto lze pozorované změny považovat za výsledek podávání CELERGENU.

3.3. Plazmatické oxidační markery a antioxidanty

Podávání CELERGENU překvapivě neovlivnilo několik markerů metabolismu glutathionu, jako jsou celkové hladiny glutathionu (rozmezí normality: 0,5–1,6 mg / g Hb) a aktivity glutathion-S-transferázy a glutathionperoxidázy (rozmezí normality: 0,2–0,7 U / mg Hb a 18,0–54,0 U / g Hb, resp.) (obrázky 2 (a), 2 (b) a 2 (c)). Současně byly statisticky významně zvýšeny hladiny dusitanů / dusičnanů a MDA v plazmě (rozmezí normality: 70,3–221,0 μM a 1,0–2,2 μM) (p <0,05 ap <0,0001), i když zůstaly v normálním fyziologickém rozmezí stanoveném v naší laboratoři (obrázky 3 (a) a 3 (b)). Aktivita extracelulárního Cu, Zn-SOD3 byla mírně potlačena (p <0,001), ale neklesla pod hranici normality (5,0–20,1 U / ml) (obrázek 3 (c)).

 

 

Obrázek 2

Parametry cyklu glutathionu: hladiny erytrocytů v celkovém glutathionu (redukované a oxidované formy, GSH + GSSG) (a) a enzymatické aktivity erythrocytů glutathion-S-transferázy (b) a glutathionperoxidázy (c) ve studované skupině pacientů (n = 41), před a po období podávání doplňku stravy. Hodnoty jsou reprezentovány jako průměr (□), standardní chyba průměru (horní a dolní hranice pole) a 1,96 × standardní chyba (horní a dolní vousy). GSH: snížený glutathion; GSSG: oxidovaný glutathion; RBC: červené krvinky; Hb: hemoglobin; GST: glutathion S-transferáza; GPx: glutathionperoxidáza. Referenční rozmezí normality: RBC celkový glutathion (0,5–1,6 mg / g Hb); Aktivita RBC GST (0,2–0,7 U / mg Hb); Aktivita RBC GPx (18,0–54,0 U / g Hb).

Obrázek 3

Markery systémového oxidačního stresu: plazmatické hladiny dusitanů / dusičnanů (NO2 + NO3) (a), malonyldialdehydu (MDA) (b) a Cu, Zn-superoxiddismutázy 3 (Cu, Zn-SOD3) (c) v studijní skupina pacientů (n = 41), před a po období podávání doplňků stravy. Hodnoty jsou reprezentovány jako průměr (□), standardní chyba průměru (horní a dolní hranice pole) a 1,96 × standardní chyba (horní a dolní vousy). Významné rozdíly mezi skupinami (p) jsou uvedeny v příslušných panelech. NO2 + NO3: dusitany + dusičnany; MDA: malonyldialdehyd. Referenční rozmezí normality: plazma NO2 + NO3 (70,3–221,0 μM); plazma MDA (1,0–2,2 μM); plazma Cu, Zn-SOD3 (5,0–20,1 U / ml).
 

3.4. Parametry metabolismu kolagenu a ATP

Bylo zjištěno, že plazmatický obsah hydroxyprolinu je vysoce zvýšený (p <0,01) (obrázek 4 (a)), stejný s obsahem ATP v erytrocytech (p <0,001) (obrázek 4 (c)), i když celkový obsah koenzymu Q10 nebyl změněn po doplnění nutraceutikem obsahujícím koenzym Q10 (obrázek 4 (b)).

Obrázek 4

Metabolické parametry související se syntézou kolagenu a ATP: hladiny hydroxyprolinu (a) v plazmě a lipofilního antioxidačního celkového koenzymu Q10 (redukované a oxidované formy, CoQ10H2 + CoQ10) (b) a erytrocytového ATP (c) ve studované skupině pacientů ( n = 41), před a po období podávání doplňku stravy. Hodnoty jsou reprezentovány jako průměr (□), standardní chyba průměru (horní a dolní hranice pole) a 1,96 × standardní chyba (horní a dolní vousy). Významné rozdíly mezi skupinami (p) jsou uvedeny v příslušných panelech. CoQ10H2: redukovaný koenzym Q10; CoQ10: oxidovaný koenzym Q10; ATP: adenosintrifosfát; RBC: červené krvinky. Referenční rozmezí normality: celkový koenzym Q10 (0,4–1,6 mg / l); ATP (1,0–4,0 mM).

4. Diskuze

V předběžné ex vivo studii složek CELERGENU proti poškození UVA v biopsiích lidské kůže a fibroblastech inhibovaly mořské kolagenové peptidy, ale ne komplex rostlinných antioxidantů, transkripční a posttranskripční matrix metaloproteinázu-1 a upregulaci elastázy, což autoři předpokládají klinickou proveditelnost prevence fotoagingu kůže. Naproti tomu jiná publikace prokázala, že bioflavonoid luteolin, složka antioxidačního komplexu CELERGEN, účinně tlumil poškození DNA, zánět a nadprodukci ROS v kožních buňkách in vitro a in vivo [46].

V této studii jsme získali přesvědčivá klinická data o účinnosti mořského kolagenového peptidu a rostlinné antioxidační formulace CELERGEN při zlepšování dermální depozice a struktury kolagenu (tabulka 2) a také pružnosti pokožky (tabulka 4). Tyto účinky byly konzistentní se zvýšenými plazmatickými hladinami hydroxyprolinu, systémového metabolického markeru syntézy kolagenu (obrázek 4 (a)). Téměř 100 % lidského Hypu se ve skutečnosti nachází v kolagenu. Hyp je oxidační derivát prolinu, obě aminokyseliny jsou nezbytné pro biosyntézu kolagenu, zrání, způsob ukládání a strukturu kolagenových vláken. Příjem prolinů v potravě podporuje opravu tkání u lidí a zvířat. Nedávno Wang et al. uvedli experimentální důkazy, že MCP mohou zlepšit syntézu a zrání kolagenu indukcí exprese transformujícího růstového faktoru beta-1 (TGF-β1) a základního fibroblastového růstového faktoru (bFGF). Naše data (obrázek 4 (a)) jsou v souladu s dříve publikovanými údaji o potkanech krmených MCP z kůže lososa nebo pstruha, což ukazuje, že plazmatické hladiny volné a dipeptidové (Pro-Hyp) formy hydroxyprolinu byly po jednorázovém příjem MCP v sójovém oleji. Podobné údaje o hladinách Hyp a peptidů obsahujících Hyp v krvi byly získány u zdravých lidských dobrovolníků. 

Četné studie na zvířatech o účincích orálního podávání přírodních nebo syntetických antioxidantů na depozici kolagenu, hladiny reaktivních druhů a antioxidační obrany generovaly vysoce protichůdná data, v závislosti na experimentálním systému. S různými modely hojení ran tak bylo opakovaně prokázáno, že buď komplexní rostlinné extrakty obsahující aktivní sekundární metabolity (triterpeny, polyfenoly, alkaloidy atd.), nebo složení polysacharidů indukujících kolagen jako chitosan a antioxidanty jako kurkumin nebo resveratrol zlepšily hojení ran, což zvyšuje depozici kolagenu v pokožce, potlačuje prozánětlivé iNOS a myeloperoxidázu, snižuje patologicky zvýšené hladiny MDA a peroxidu vodíku a zlepšuje enzymatickou antioxidační obranu. Nedávné studie ukázaly, že kolagenové peptidy z rybí kůže pozoruhodně podporovaly jak hojení ran, tak angiogenezi v různých experimentálních podmínkách. Důležité je, že nadměrný NO produkovaný během zánětlivé fáze procesu hojení ran narušil akumulaci kolagenu, zatímco mírné hladiny NO urychlily granulační fázi uzavření rány. Kromě toho bylo v řadě experimentálních a klinických studií prokázáno zrychlení hojení ran mírnými hladinami H2O2 indukcí vaskulárního endoteliálního růstového faktoru v keratinocytech a makrofágech. Zde jsme zjistili, že spolu s akumulací Hyp byly plazmatické hladiny dusitanů a dusičnanů související s produkcí NO v krevním řečišti po léčbě přípravkem CELERGEN mírně zvýšeny, i když zůstaly v rozmezí normálních hodnot (obrázek 3 (a)). Podobné výsledky byly získány s plazmatickým MDA (obrázek 3 (b)). To nám umožnilo navrhnout, že by mohlo dojít k redoxní regulaci procesu syntézy kožního kolagenu nebo k aktivaci proliferace fibroblastů kvůli fyziologicky relevantním množstvím NO a / nebo MDA generovaným po příjmu doplňku. Návrh si však zaslouží další mechanistický in vitro a klinický výzkum.

Na druhé straně v modelech srdeční fibrózy [58, 59] byl významný pokles modelového oxidačního stresu získaného použitím extraktu z ovoce momordica charantia nebo celkových flavonoidů Fructose Chorpondiatis skutečně spojen se současným útlumem depozice kolagenu, jak je hodnoceno hladinami Hyp. Podobné výsledky byly získány u jiných tkáňových modelů fibrózy, včetně fibrózy kůže. Zdá se, že komplexní směsi ovocných extraktů obsahovaly jak látky ovlivňující syntézu kolagenu, tak antioxidanty.

Ultrafialové záření by mohlo způsobit kožní poškození, které by způsobilo příznaky předčasného stárnutí. Při hodnocení fotoprotektivních účinků dietních MCP izolovaných z medúz nebo z rybího měřítka v modelu chronického ozařování myší UVA + UVB dospěli autoři k závěru, že MCP zlepšily imunitu kůže, snížily ztrátu vody, obnovily kožní kolagen a hladiny a struktura elastinu a udržovaný poměr kolagenu typu III k I. Podle podobného experimentálního návrhu Zhuang et al. prokázali ochranný účinek MCP na antioxidační aktivity enzymů a obsah glutathionu, lipidů a hyp v myší kůži. V této souvislosti jsme zjistili významné snížení (v rozsahu normality) plazmatické aktivity SOD3 po doplnění CELERGENEM (obrázek 3 (c)). Extracelulární plazmatický Cu, Zn-SOD3, glykoprotein s doménou vázající heparin, je převážně exprimován v tkáňové ECM, kde je vázán na proteoglykan heparinsulfátu [65]. Fyziologicky udržuje SOD3 redoxní rovnováhu a homeostázu tkání a moduluje vrozené a adaptivní imunitní reakce. Kožní homeostáza silně závisí na mikroprostředí ECM; zvýšená aktivita SOD3 proto může být markerem adaptivní reakce proti vnitřním rizikům souvisejícím s věkem a vnějším rizikovým faktorům vyvolávajícím imunitní potlačení v kůži.

Vzhledem k tomu, že suplementace sloučenin s přímým antioxidačním účinkem dosud neprokázala klinickou účinnost a někdy dokonce zhoršil klinický obraz [67], bylo hledání léků / terapeutických strategií pro modulaci oxidačního stresu v dnešní době drasticky přesměrováno na nepřímé AO indukování endogenního enzymatického systému antioxidační obrany, zejména cestou spojenou s Nrf2; selektivní inhibitory enzymů produkujících ROS / RNS, například různé izoformy NADPH-oxidázy, které vykazují určité klinické účinky; rozpoznání podstatných a mnohonásobných fyziologických rolí redoxních vyrovnávacích činidel spíše než pouhé inhibitory procesů volných radikálů. Zdá se, že všechny tyto multipotentní schopnosti mají polyfenoly odvozené z rostlin, kvercetin, resveratrol, luteolin a mnoho dalších. Přítomnost kvercetinu a resveratrolu z extraktu z hroznové kůže a luteolinu v antioxidační kombinaci CELERGENU pak může dobře vysvětlit pozorované redoxní vyrovnávací účinky během upregulace syntézy kolagenu vyvolané MCP (obrázky 2, 2 a 2 (c)). Většina publikací ve skutečnosti prokázala pokles obsahu GSH a zvýšení ochranné GPx aktivity, když byl zvýšen obsah Hyp. Velmi důležitá přítomnost antioxidantů v testované formulaci, i když možná chrání redoxní rovnováhu před škodlivými vedlejšími účinky metabolismu kolagenu, neměla negativní vliv na požadovaný proces syntézy / depozice dermálního kolagenu. Ve skutečnosti bylo pozorované zvýšení plazmatického Hyp srovnatelné s tím, které bylo nalezeno dříve, s čistými rybími MCP v mnohem vyšších dávkách.

V posledním desetiletí endogenně produkované systémové a kožní redoxaktivní látky (superoxid, peroxid vodíku, NO, lipidové peroxidy, stabilní konečné produkty peroxidace lipidů, oxidační metabolity cholesterolu a skvalenu atd.), Dříve uznávané výlučně jako nežádoucí metabolické látky - produkty a markery oxidačního poškození, prokázaly základní funkce buněčné signalizace a regulace buněčné proliferace, diferenciace, migrace, vrozené imunity, produkce energie, dynamiky ECM, vaskulárního tonusu, stresových reakcí a adaptace a zánětu. V tomto rámci může mírné plazmatické zvýšení MDA (obrázek 3 (b)) a NO (obrázek 3 (a)) pozorované v této studii odrážet regulační funkce těchto mediátorů jak při syntéze kolagenu vyvolané MCP (obrázek 4 (a )) a v procesu produkce mitochondriální ATP (obrázek 4 (c)). Pouze nadměrné množství je škodlivé, protože vyvolává stárnutí a smrt buněk. Zdá se, že bez ohledu na doplňování koenzymu Q10 během kurzu CELERGEN nebyly jeho plazmatické hladiny zvýšeny (obrázek 4 (b)), kvůli zvýšené spotřebě koenzymu v mitochondriálním cyklu produkce energie zvyšující ukládání ATP v erytrocytech (obrázek 4 (c )) a v řízení redoxní rovnováhy buněk (obrázky 2 (a) –2 (c)).

Anti-ageí účinky suplementace CELERGEN byly prokázány také vysoce zvýšenou produkcí mazu (tabulka 4). Je prokázáno, že produkce mazových lipidů je silně závislá na věku, je nízká v prepubertálním období, roste se sexuálním zráním a postupně klesá ve stárnoucí populaci (od 46–55 let) nebo v předčasném UV záření stárnutí kůže. Podle toho se rozpadají kožní lipidy rozpustné antioxidanty, jako je vitamin E a skvalen. Vzhledem k tomu, že lipidy na povrchu pokožky (SSL) hrají několik důležitých rolí ve vlastnostech bariéry pokožky, hladkosti pokožky, pružnosti a vlhkosti, jsou považovány za přirozené stráže normální kožní ekologie. Mírné koncentrace specifických nenasycených složek SSL (skvalen, cholesterol a volné mastné kyseliny) jsou navíc schopné generovat oxidované lipidové vedlejší produkty (MDA, 4-hydroxynonenal, oxidovaný cholesterol a další), protože jsou dlouho považovány za klíčové signální molekuly pro imunitní a metabolické reakce kůže na urážky prostředí a mikrobiální útočníky. Na druhé straně by nadměrné hladiny mikrobiálně nebo fotooxidovaných derivátů nenasycených mastných kyselin a dalších lipidů kožního mazu mohly vyvolat začarovaný kruh nadprodukce kožního mazu následovaný oxidací, čímž by se zachoval zánět charakteristický pro onemocnění akné. Jak ukazují naše klinické údaje (tabulka 1), nebyly během studie zaznamenány žádné stížnosti na stav kůže. Naopak výrazné zlepšení elasticity kůže lze připsat nejen depozici kolagenu v dermě, ale také mírnému fyziologickému nárůstu obsahu SSL.

Na základě získaných výsledků a stávajících údajů z literatury jsme předpokládali redoxně závislé dráhy (obrázek 5), které mohou vést ke klinickým a obecným účinkům doplňku CELERGEN na zdraví. Je zřejmé, že hlubší základní výzkum a k prokázání této hypotézy a vyhodnocení základních mechanismů jsou zapotřebí další klinické studie.

Obrázek 5

Schéma předpokládaných redoxně závislých mechanismů fyziologických účinků CELERGENU. Mořské kolagenové peptidy (MCP) snadno pronikají do gastrointestinální stěny (GI, tři šipky) a prostřednictvím krevního oběhu se ukládají hlavně v kůži. Antioxidační složka nutraceutika je částečně metabolizována v GI, takže má nízkou biologickou dostupnost (jedna šipka); antioxidanty zaměřené na kůži a jejich metabolity však dosahují různých vrstev pokožky. Zatímco jsou v oběhu, MCP stimulují krevní fagocyty (granulocyty a monocyty) a endoteliocyty (E) k produkci reaktivních forem kyslíku (ROS) a reaktivních forem dusíku (RNS) aktivací Toll-like receptorů 4 (TLR4). Hydroxyprolin (HYP) a prolyl-hydroxyprolin (Pro-HYP) dipeptidy jako hlavní složky MCP jsou metabolizovány odpovídajícími oxidázami a jako vedlejší produkty vznikají hydroxylové radikály. Antioxidanty zabraňují systémovému oxidačnímu stresu blokujícímu oxidaci GSH, GPx, GST a SOD3. V pokožce se zvyšuje syntéza a ukládání kolagenu i pružnost, zatímco (hypoteticky) jsou nízké hladiny oxidovaných forem lipidů v kůži, jako jsou nenasycené mastné kyseliny (PUFA-ox), skvalen (Sq-ox), malonyldialdehyd (MDA), a 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE) může usnadnit buněčnou signalizaci pro syntézu ATP a produkci kožního mazu.

5. Závěr

Přidání dietních antioxidantů pocházejících z rostlin se známým tropismem kůže a zdravotními účinky na lidskou pokožku nezhoršilo definitivní vyvolání syntézy kolagenu a jeho ukládání jako kompaktních organizovaných vláken v dermální vrstvě kolagenovými peptidy odvozenými z kůže mořských ryb. Další příznivé účinky antioxidantů byly pozorovány systémově, protože byla udržována normální rovnováha systémové endogenní antioxidační obrany a nastala ochrana skladování energie.

Poděkování

Autoři oceňují děkují společnosti Suisse Ueli Corporation za poskytnutí produktu pro klinickou studii zdarma a za pokrytí nákladů na činidla a analýzy. Jsou také vděční Eleně Schukinové za vynikající technickou pomoc a Valeriji Čertuškinovi za organizaci zkušební logistiky.

Autoři prohlašují, že nejsou v konfliktu zájmů.

 

Zdroj: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4745978/#B36